Диагностика и мониторинг больных с помощью маркеров днк- и рнк-содержащих вирусов

(Опухоли вирусного происхождения и их диагностика)

Российская академия медицинских наук

Онкологический научный центр
Им. Н.Н. Блохина

Лаборатория вирусного канцерогенеза
зав. д.м.н., проф. В.Э. Гурцевич

г. Москва 115 478,
Каширское шоссе, дом 24

Тел. 323-57-55; 324-25-64;
E-mail: senyuta@front.ru
E-mail: gurtsevitch@crc.umos.ru

Лаборатория вирусного канцерогенеза с 1962 г. занимается изучением опухолей вирусного происхождения.

В последние два десятилетия приоритетными для лаборатории стали направления исследований, связанные с изучением опухолей человека, ассоциированных с вирусами.

При этом особое внимание уделяется диагностике этих заболеваний с помощью вирусных маркеров.

Диагностика лимфопролиферативных и эпителиальных новообразований человека с помощью маркеров вируса эпштейна-барр

Вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), открытый в 1964г., является высоко специфическим лимфотропным вирусом человека. В последние годы, однако, доказана его способность инфицировать и эпителиальные клетки.

ВЭБ широко распространен среди населения любой страны мира и обладает горизонтальным путем передачи. Первичное заражение этим вирусом, как правило, происходит в раннем детском возрасте. При этом возраст в момент первичной инфекции является принципиальным фактором.

Инфицирование в раннем возрасте, как правило, протекает бессимптомно или сопровождается неспецифическими клиническими проявлениями в виде ангин, ларингитов, фарингитов и т.д. Результатом такой инфекции является продукция гуморальных антител ко всему спектру антигенов ВЭБ, которые на всю жизнь обеспечивают стойким иммунитетом к инфекционному мононуклеозу (ИМ).

При первичном заражении в старшем детском и юношеском возрасте приблизительно у 50% инфицированных лиц возникают классические формы ИМ, в возникновении которых вирус играет этиологическую роль. В настоящее время известен широкий спектр патологических состояний человека, в возникновении которых ВЭБ принимает непосредственное участие. Среди них важное место занимают злокачественные новообразования, такие как лимфома Беркитта, определенные гистологические варианты болезни Ходжкина, неХоджкинские лимфомы, возникающие на фоне иммунодефицитных состояний, а также рак носоглотки, лимфоэпителиома слюнных желез и другие опухоли лимфоидного и эпителиального происхождения.

Лаборатория обладает уникальным опытом диагностики и дифференциальной диагностики ВЭБ-ассоциированных состояний человека на базе серологического профиля ВЭБ-специфических антител и ПЦР-диагностики. Основным достоинством выполняемого в лаборатории серологического теста, в отличие от широко используемых коммерческих тест-систем типа ELISA, является его высокая специфичность, надежность, возможность не только обнаружить антитела к широкому спектру вирусных антигенов, но и определить их титры, что для диагностики имеет принципиальное значение.

Динамическое наблюдение за уровнем гуморального ответа к антигенам ВЭБ позволяет также контролировать клиническое состояние больных, оценивать эффективность проводимой терапии и прогнозировать течение болезни.

Диагностика ряда лимфопролиферативных заболеваний, включая инфекционный мононуклеоз, и синдром "хронической усталости" с помощью маркеров герпесвируса человека 6-го типа (hhv-6)

Этот представитель семейства герпетических вирусов человека (HHV-6) впервые был выделен в 1986 г. из лимфоцитов периферической крови больных лимфопролиферативными и иммунодефицитными заболеваниями.

Проведенные сероэпидемиологические исследования больных и здоровых лиц, проживающих в различных регионах планеты, показали, что HHV-6, подобно большинству герпетических вирусов человека, является убиквитарным, т.е. широко распространенным среди населения вирусом. Высокие титры антител к HHV-6 выявляются у больных лимфопролиферативными заболеваниями и больных с различными нарушениями иммунного статуса.

В настоящее время установлено, что первичное инфицирование HHV-6 детей раннего детского возраста вызывает у них так называемую "розовую сыпь новорожденных". Описан случай фатального гемофагоцитарного синдрома, вызванного этим вирусом. От 12% до 30% случаев инфекционного мононуклеоза, негативных по гетерофильным антителам, этиологически связаны с HHV-6. Предполагается участие этого вируса в возникновении синдрома "хронической усталости" и другой патологии.

В практике нашей лаборатории мы все чаще выявляем случаи инфекционного мононуклеоза, вызванного HHV-6, и его высокую активность при различных иммунодефицитных состояниях, что существенно облегчает диагностику и дифференциальную диагностику инфекционного мононуклеоза, ряда других лимфопролиферативных и иммунодефицитных состояний, а также гемобластозов различного генеза. А поскольку в настоящее время разработаны эффективные противовирусные препараты, их использование при правильной диагностике и соответствующей патологии дает хороший терапевтический эффект.

Диагностика HHV-6-ассоциированных состояний человека в нашей лаборатории проводится на базе серологического профиля антител специфических к вирусу методом непрямой иммунофлуоресценции.

Диагностика саркомы капоши и некоторых других лимфопролиферативных заболеваний с помощью маркеров герпесвируса человека 8-го типа (hhv-8)

Вирус саркомы Капоши (KSHV) или герпесвирус 8-го типа (HHV-8) был открыт в 1994 г. и в настоящее время рассматривается в качестве этиологического агента при всех известных формах саркомы Капоши (т.е. классической или идиопатической, СПИД-ассоциированной, эпидемической и пост-трансплантационной).

Все указанные формы саркомы Капоши (СК) (за исключением эпидемической) были зарегистрированы в России и странах бывшего СССР. Кроме СК, выраженная ассоциация HHV-8 обнаружена со злокачественным заболеванием под названием первичной выпотной лимфомы, а также некоторыми агрессивно протекающими случаями болезни Кастельмана.

Исследования, проведенные с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) показали, что опухолевая ткань от практически любого больного СК, вне зависимости от клинической формы и стадии болезни, а также инфицированности ВИЧ, содержит последовательности HHV-8. У 30%-50% больных СПИД-ассоциированной формой СК вирусная ДНК также может быть обнаружена в циркулирующих В-клетках крови.

Из серологических исследований следует, что вирусспецифические антитела к HHV-8 могут быть обнаружены примерно у 85% больных СПИД-ассоциированной и >90% больных классической формами СК. У здоровых лиц эти антитела встречаются в незначительном проценте случаев (менее 5%).

Клинические и эпидемиологические наблюдения показали, что заболеваемость СК в стране в последние годы постоянно нарастает. Это связано с постоянно увеличивающимся числом лиц с иммунодефицитными состояниями (на фоне которых и возникает заболевание), в частности, у лиц, инфицированных ВИЧ, больных, подвергшихся трансплантации органов, онкологических больных, принимающих иммунодепрессанты и больных хроническими системными заболеваниями.

Учитывая недостаточную эффективность и объективную сложность современных клинических и морфологических методов диагностики СК, ПЦР-диагностика и серологические исследования, направленные на выявление вирус-специфических маркеров у обследуемых лиц, являются незаменимыми для диагностики и дифференциальной диагностики СК. Хорошо известно, что ранняя диагностика СК способствует более эффективному лечению и более благоприятному прогнозу.

Диагностика антител к вирусу т-клеточного лейкоза человека (htlv-i/ii)

Вирус Т-клеточного лейкоза человека 1-го типа (Human T-cell leukemia viruses type I - HTLV-I), открытый в 1980 г., относится к онкогенным вирусам и способен вызывать особую форму лейкоза, так называемый Т-клеточный лейкоз взрослых (ATL).

Заболевание у инфицированных HTLV-I людей развивается после длительного инкубационного периода и характеризуется исключительно злокачественным течением и рядом других клинических особенностей. HTLV-I, помимо онкологических заболеваний, способен вызывать неврологические заболевания такие как, тропический спастический парапарез (TSP), различные миопатии, а также целый ряд воспалительно-дегенеративных заболеваний (миозиты, увеиты, дерматиты, бронхопневмонии).

Пути передачи вируса HTLV-I хорошо известны, это гемотрансфузия инфицированной крови, половой путь и от матери к ребенку во время грудного вскармливания. У инфицированных лиц в сыворотке крови определяются антитела к белкам вируса HTLV-I, а в лимфоцитах последовательности вирусного генома.

В связи с выше сказанным, своевременная диагностика HTLV-I и профилактические меры по предотвращению его распространения являются необходимыми и важными в современной медицине.

В лаборатории вирусного канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН проблемой HTLV-I и ассоциированных с ним заболеваний занимаются с 1985г.

Диагностика антител к белкам HTLV-I на базе нашей лаборатории проводится рядом методов:

1. Реакция пассивной агглютинации с использованием диагностического набора Serodia HTLV, Fujerebio inc. Japan. Этот тест является скринирующим. Образцы сывороток имеющие титры анти-HTLV-I антител 1:8 и выше оцениваются как положительные.

2. Реакция белкового иммуноблотинга с использованием диагностического набора Problot HTLV-I, Fujerebio inc. Japan. Сыворотки в которых обнаружены антитела к белкам HTLV-I Gag (gp 46) и Env (p24, p19) оцениваются как положительные.

3. Реакция белкового иммуноблотинга с использованием диагностического набора HTLV BLOT 2.3. Diagnostic Biotechnology (Pte) Ltd. USA. С помощью этой реакции осуществляется дифференциальный анализ между HTLV-I и HTLV-II. Исследуемые образцы тестируются методами №2 и №3 в том случае, если сыворотка позитивная либо неопределенная в скринирующем тесте Serodia HTLV.

Диагностика и мониторинг больных герминогенными опухолями с помощью новых вирус-специфических маркеров herv-k

Развитие герминогенных опухолей (ГО), в том числе и яичка этиологически связывают с эндогенным ретровирусом человека семейства "К" (HERV-K).

Нашими исследованиями на большом клиническом материале доказана диагностическая и прогностическая ценность антител к Gag и Env белкам HERV-K при ГО. Указанные серологические маркеры эффективно дополняют, а иногда оказываются и более чувствительными по сравнению с традиционными маркерами (альфа-фетопротеин, хориогонадотропин, лактатдегидрогеназа), применяемыми для диагностики и мониторинга герминогенных опухолей.

Обнаружение и динамика титров гуморальных антител к указанным белкам является важной информацией для клиницистов при диагностике опухолей яичка и мониторинга больных герминогенными опухолями в процессе лечения. Антитела к Gag и Env белкам HERV-K/HTDV обнаруживаются у больных при всех морфологических формах герминогенных опухолей в среднем в 67% случаев.

Наиболее часто вирусспецифические антитела выявляются при семиномах, в смешанных опухолях с элементами семиномы и опухолях желточного мешка. Вирус-специфические антитела определяются и у больных герминогенными опухолями внегонадного происхождения. Изменение титров антител отражают процессы ремиссии либо рецидива заболевания, а также позволяют оценить эффект проводимой терапии.

Кроме того, антитела, сохраняющиеся у больных герминогенными опухолями после завершения всех курсов химиотерапии, свидетельствуют о наличии в организме больного живых опухолевых клеток, что представляется крайне важным для оценки прогноза болезни, а также для выбора тактики лечения.

Антитела к Gag и Env белкам HERV-K/HTDV выявляются методом непрямой иммунофлуоресценции на клетках насекомых Sf158, инфицированных рекомбинантными белками Gag и Env. Постановка реакции занимает 1 день и требует около 0,5 мл сыворотки крови больного.

Для проведения диагностического исследования на указанные вирусные маркеры требуется 200-300 мкл сыворотки крови (либо 3-4 мл цельной крови в сухой пробирке).

Время проведения анализа в зависимости от поставленной задачи занимает от 1 до 3-х дней.

Для ПЦР диагностики требуется цельная кровь (с детергентом) или биопсийный материал исследуемой ткани. Время проведения анализа - 3-5 дней.

Дизайн и поддержка: Ардис Медиа Отличный хостинг: Beget.ru